咖啡影響多種生理過程，包括腸道功能、壓力、認知及微生物群。然而，這些影響的潛在機制仍未被充分理解。本研究旨在探討咖啡對微生物-腸道-腦軸（一個腸道微生物群與大腦之間的雙向溝通途徑）的影響，並評估這些影響是否獨立於咖啡因在健康參與者中發生。我們的主要結果是微生物群的組成和功能，次要結果是腸道微生物代謝物和咖啡相關代謝物（NCT05927038 和 NCT05927103）。糞便微生物群組成出現顯著的群體差異，咖啡飲用者表現出較高的糞便隱孢菌（Cryptobacterium）和艾格特氏菌（Eggerthella）物種的相對豐度，同時伴隨吲哚-3-丙酸、吲哚-3-甲醛和神經遞質γ-氨基丁酸等代謝物的水平降低。行為上，咖啡飲用者表現出更高的衝動性和情緒反應，而非咖啡飲用者則展現出更好的記憶表現。部分糞便代謝物的改變在停止飲用咖啡後是可逆的，而重新攝取咖啡則會引發獨立於咖啡因的急性微生物群變化。整合模型確定了九種關鍵代謝物——包括茶鹼、咖啡因和選定的酚酸——與微生物物種和認知測量高度相關。這些發現揭示了咖啡對微生物-腸道-腦軸先前未被認知的影響，表明微生物群譜系可能預測咖啡攝取模式，並突顯了咖啡攝取與腸道微生物組成之間的密切關聯。
咖啡是一種由加工咖啡豆製成的植物性飲料。其風味和成分因豆種、成熟度、加工、烘焙和沖泡方法而異。咖啡中的關鍵植物化學物質包括生物鹼（如咖啡因）、（多）酚類（如酚酸）、二萜類和烘焙過程中形成的類黑素。適度飲用咖啡與多種健康益處相關，包括降低罹患第二型糖尿病、肝臟疾病、心血管疾病和癌症的風險。在一項針對 468,629 名無臨床心血管疾病個體的大型橫斷面研究中，輕度至中度飲用咖啡與全因死亡率、心血管死亡率和中風發生率較低有關。此外，咖啡攝取在多個人群隊列中持續與劑量依賴性地降低帕金森氏症的風險相關。薈萃分析也發現，咖啡飲用者罹患憂鬱症的風險較低，而一項針對認知衰退的世代研究的薈萃分析顯示，咖啡攝取使阿茲海默症的發生率降低了 27%。
這些全身性的益處伴隨著咖啡直接影響大腦的證據，塑造了神經活動和認知結果。功能性核磁共振研究顯示，習慣性咖啡飲用者在與感覺、運動和情緒處理相關的區域表現出改變的功能連接。這些改變似乎取決於攝取頻率，表明規律飲用咖啡可能影響大腦功能和情緒調節。近期數據顯示，老年人認知表現，特別是記憶力和處理速度，與咖啡攝取呈正相關。咖啡攝取會導致皮質醇水平暫時升高，隨後在習慣性使用後恢復正常，表明生理適應。然而，咖啡對壓力的影響仍不明確，研究結果不一。
咖啡也會影響胃腸道。它會增加胃酸度並刺激有助於消化的激素釋放。含咖啡因和無咖啡因的咖啡都能促進迴腸和結腸平滑肌的收縮，有助於預防便秘。顯然，咖啡透過直接和間接機制影響人類健康和生理。直接效應來自咖啡化合物或其循環代謝物與特定生物靶點之間的相互作用，而間接效應則涉及透過腸道微生物群等系統的變化。
越來越多的體外、動物和人體研究證據表明，腸道中的微生物對咖啡也有反應，咖啡具有類似益生元對腸道微生物群的作用。這主要歸因於其纖維狀化合物和酚類，如綠原酸（CGAs），包括咖啡oyl奎寧酸、阿魏oyl奎寧酸和香豆oyl奎寧酸。例如，咖啡中的類黑素可能透過促進產生短鏈脂肪酸（SCFA）的細菌生長來提高血清短鏈脂肪酸水平。此外，一些研究表明，咖啡攝取促進擬桿菌屬（Bacteroides）和屬於雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的益生菌物種的生長。咖啡（多）酚的生物利用度和代謝在個體之間差異很大，這種現象受到腸道微生物群的影響。咖啡酚類也可能透過激活大腦中的抗氧化反應因子來減少神經炎症。
一項涉及一千多名參與者的近期宏基因組學研究，檢驗了超過 150 種飲食成分與腸道微生物群組成之間的關係。該研究發現咖啡攝取是劑量依賴性最強的相關食物項目；隨後在第二個隊列中進行了驗證。咖啡對認知的影響可能透過其與腸道微生物群的相互作用來介導。例如，咖啡攝取與產生丁酸鹽的有益腸道細菌（如 Lawsonibacter asaccharolyticus）水平較高有關。事實上，人們越來越認識到食物和飲料對構成微生物-腸道-腦軸的雙向信號傳導通路的重要性。
儘管流行病學和機制研究強烈地將咖啡攝取與改善健康結果聯繫起來，但仍存在關鍵的差距。首先，咖啡攝取、戒斷和重新攝取的時序動力學仍未被充分理解。其次，尚未系統性地檢驗由腸道微生物群塑造的咖啡酚類個體代謝變異的作用。最後，微生物群作為咖啡攝取與大腦功能之間介導者的貢獻尚未確定。
本研究旨在透過自我報告問卷，在微生物-腸道-腦軸的背景下，探討咖啡攝取、戒斷和重新攝取對認知、情緒和行為的時序效應。因此，與行為分析同時進行，我們使用宏基因組學和靶向/非靶向代謝組學，對健康、成年、中度咖啡飲用者與非咖啡飲用者進行腸道微生物群的同時分析。此外，還探討了微生物-腸道-腦軸的不同通路，如壓力、炎症和微生物衍生的代謝物。我們旨在透過幾種機制來探究咖啡對微生物群和認知的影響之間的重疊。透過（多）酚類，透過增加產生丁酸鹽的細菌的有益作用，或透過咖啡改變神經活性化合物（如 SCFA 或 γ-氨基丁酸）來改變腸道-腦軸。此外，我們還探討了咖啡酚類代謝的個體變異，以及微生物群如何影響這種變異。雖然本研究考慮了咖啡因的作用，但咖啡作為一種複雜的混合物，含有許多可能影響腸道的其他化合物。
我們假設咖啡攝取對腸道微生物群有獨特影響，增加微生物多樣性和有益的腸道健康介質，其中一些可能依賴於咖啡因，而另一些則不然。這些變化可能透過增強的壓力抵抗力和認知表現來促進大腦功能的改善，從而透過咖啡、微生物群和認知之間的獨特相互作用，將咖啡攝取與微生物-腸道-腦軸聯繫起來。
這項前瞻性研究分為三個階段，每個階段都評估了認知、壓力、身體健康、情緒、免疫功能、腸道微生物群、飲食攝取和代謝物組成（設計請參見圖 1）。首先，我們比較了非咖啡飲用者（NCD，n = 31）與咖啡飲用者（CD，n = 31），然後 CD 組停止飲用咖啡 14 天。在此清洗期後，參與者重新攝取無咖啡因（n = 15）或含咖啡因咖啡（n = 16）21 天（圖 1A）。NCD 組的參與者未參與研究的後續階段。總體而言，女性參與者較多，且大多數參與者是經陰道出生（表 1）。基線時，CD 組參與者每日咖啡因攝取量高於 NCD 組，且 NCD 組在基線訪視前放棄的咖啡因較多（表 1，補充數據 1），儘管放棄的量遠低於被認為是成癮的水平。酒精攝取量、教育年限、童年創傷問卷（CTQ）子分數和預測 IQ（使用國家成人閱讀測試（NART）測量）在各組之間沒有差異（表 1）。在研究干預階段比較含咖啡因和無咖啡因咖啡飲用者之間的這些指標時，每日咖啡因攝取量、放棄的咖啡因量、酒精攝取量、教育年限、CTQ 子分數和預測 IQ 在這些組之間沒有差異（補充數據 15）。所有參與者均對 ADORA2A 基因的咖啡因敏感性相關 SNP rs2298383 和 rs5751876 進行了基因分型。NCD 組在 rs2298383 中具有較高的 C/C 單倍型百分比，而 CD 組則有較多的 C/T。對於 rs5751876，NCD 組有較多的 T/T，而 CD 組有較多的 C/T（表 1，補充圖 1）。先前研究表明，T/T 單倍型與較高的咖啡攝取量有關。這種差異可能表明，在該人群中，情境、環境或樣本特定的因素調節了基因型與咖啡因攝取之間的關係。
A 實驗概述，基線時（V2）的 NCD 和 CD 飲用者，停止飲用咖啡 2 週後（V3）的 CD 飲用者，以及重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡 3 週後的 CD 飲用者。樣品類型、問卷類型在每個面板中標示，以及研究日期。B 相對於基線 CD 的問卷結果熱圖。同一單元格內的水平條表示個別參與者的值。對於具有重複測量的咖啡飲用者子集，同一參與者的測量值在 y 軸上對齊。紅色表示正效應大小，藍色表示負效應大小，紅色或藍色的強度對應於效應大小的增加或減少，白色表示零效應。包含數字文本框的面板反映了 Cohen's d 效應大小 > 0.5 的比較，表示中等大小的效應。第一列代表完成的問卷，第二列 = NCD，第三列 = CD，第四列為 CD 的清洗期，第五列為含咖啡因或無咖啡因咖啡的重新攝取。C 含咖啡因和無咖啡因咖啡攝取者在咖啡因戒斷和重新攝取後，對渴望和疲勞症狀的問卷反應熱圖。第一列代表完成的問卷，第二列 = CD 的清洗期，第三列為含咖啡因或無咖啡因咖啡的重新攝取。比較對象為 NCD v CD、清洗期 v CD 基線以及 CAF 或 DECAF v CD 基線值。基線時 CD 和 NCD 的 n = 31，清洗期為 n = 31，無咖啡因咖啡重新攝取為 n = 15，含咖啡因咖啡重新攝取為 N = 16。縮寫：UPPS-P，衝動性、預謀性、堅持性、尋求刺激性、積極衝動行為量表；ERS，情緒和反應量表，PASAT，節奏性聽覺數字相加測驗；ModRey，改良版聽覺語言學習測驗，STAI（特質），狀態特質焦慮量表；PSS，感知壓力量表；BDI，貝克憂鬱量表；GIS-VAS，胃腸道症狀視覺模擬量表；HSCL GSI，霍普金斯症狀檢查表總體嚴重指數；PSQI，匹茲堡睡眠品質指數；IPAQ，國際體能活動問卷；QCC，咖啡因渴望問卷，CWSQ，咖啡因戒斷症狀問卷，V 訪視。
參與者的飲食攝取透過加權食物日記在每次研究訪視前監測 7 天（見補充文件）。比較 CD 和 NCD 參與者時，未觀察到飲食攝取差異（補充數據 2a）。在戒斷咖啡因 2 週後，CD 組的飲食攝取基本保持不變，但含咖啡因組報告的鎂攝取量略低，且在研究結束前保持不變，而無咖啡因組從基線到終點訪視的硒攝取量略有增加（補充數據 2b–e）。未觀察到其他宏量、微量營養素和食物組的飲食攝取差異。
在基線時 CD 和 NCD 之間沒有顯著的飲食差異後，我們使用自我報告問卷評估了總體健康狀況。在基線時，比較 CD 和 NCD，身體質量指數（BMI）、血壓、壓力、焦慮、憂鬱、胃腸道症狀、睡眠品質或體能活動沒有差異（補充數據 3）。在咖啡因清洗期後，這些指標也保持不變（補充數據 4）。在干預階段，CD 參與者在停止飲用咖啡 2 週後，收縮壓和舒張壓顯著下降（補充數據 5）。清洗期和咖啡干預後，兩組的 BMI 均保持不變，而飲用含咖啡因咖啡的參與者與無咖啡因組相比，收縮壓有所下降（補充數據 6）。
使用自我報告問卷比較 NCD 和 CD 參與者的認知狀態，CD 組在衝動行為量表（UPPS-P）及其「尋求刺激」子分數上得分顯著較高，表明對新奇事物的動機較強（圖 1B，補充數據 3）。與 NCD 組相比，CD 組在情緒反應量表（ERS）上的得分也較高（圖 1B，補充數據 3）。在習慣性咖啡飲用者停止飲用咖啡後，UPPS-P 總分和「負面衝動」分數，以及 ERS 的敏感性、強度、持續性和總 ERS 分數均顯著低於基線（圖 1B，補充數據 4）。此外，在咖啡清洗期後，參與者在 PASAT 測試中的認知表現有所改善，這可能歸因於任務重複（補充數據 4）。
為了檢驗在研究干預階段，含咖啡因和無咖啡因咖啡接受者之間這些自我報告反應的潛在差異，我們比較了干預開始時與干預結束時的問卷反應。含咖啡因組的焦慮（STAI，特質）和心理壓力（HSCL）有所減輕，而含咖啡因和無咖啡因組在感知壓力、BDI 和 UPPS-P 方面均有所改善（補充數據 5）。含咖啡因咖啡的接受者在 PASAT 上的得分也有所提高（補充數據 5），這表明清洗期後認知表現的改善並非僅僅由於任務重複。比較研究開始時與干預後期的自我報告問卷反應，兩組在 UPPS-P 和 ERS 總分及敏感性方面均有所下降。ERS 強度僅在無咖啡因咖啡飲用者中下降（補充數據 6）。干預後，總衝動性和情緒反應分數與干預開始時的分數相比有所下降（補充數據 6）。在含咖啡因咖啡飲用者中，堅持性和負面衝動性下降，而無咖啡因飲用者則出現積極衝動性下降。STAI-特質總分數在含咖啡因飲用者中下降，而 HSCL、睡眠品質（PSQI）和體能活動（IPAQ）分數在無咖啡因飲用者中有所改善（補充數據 6），這表明含咖啡因和無咖啡因咖啡可能具有獨特的心理和生理益處，可能影響其消費建議，取決於個人健康目標。
使用改良版聽覺語言學習測驗（ModRey）評估參與者的陳述性記憶表現。在基線訪視時，CD 和 NCD 在記憶表現上相似，CD 和 NCD 在延遲回憶方面均有所改善（補充數據 7）。比較研究開始時（基線）與研究結束時（干預後）的 ModRey 分數，僅在研究干預階段接受無咖啡因咖啡的參與者中觀察到顯著改善（補充數據 8）。無咖啡因組在 ModRey 測試的多個組成部分上表現出顯著改善，而含咖啡因組則沒有。這些發現可能歸因於改善睡眠品質和增加體能活動的有益影響，這兩者都已被證實能支持情景記憶表現。
在基線時，使用情緒識別任務（ERT）評估情緒處理時，CD 和 NCD 之間沒有差異。隨後在干預後，無論是含咖啡因還是無咖啡因的參與者，在 ERT 表現上與基線分數相比均無顯著差異（補充數據 8）。在基線時，比較 CD 和 NCD 在使用 PAL 任務學習和遺忘資訊方面沒有顯著差異（補充數據 7）。然而，在干預後，無咖啡因組在 PAL 錯誤方面顯著減少，而含咖啡因組則沒有，這表明咖啡的非咖啡因成分可能改善學習和記憶（補充數據 8），儘管也存在學習效應的可能性。
為了評估 CD 在 2 週咖啡戒斷期間咖啡因戒斷對其的影響，在第 2 天、第 4 天以及干預開始當天（第 14 天）進行了自我報告問卷調查（圖 1A）。在此期間，渴望分數保持穩定（圖 1C 和補充圖 S8）。在同一時期，戒斷症狀在戒斷期開始時較高，並在第 4 天和訪視 3（干預）時顯著下降。所有指標，包括嗜睡和頭痛，均顯著減輕（補充圖 S9）。使用自我報告的 VAS 測量疲勞和精力，我們觀察到 CD 參與者在戒斷期間疲勞感減輕，精力增加（補充圖 S9）。
使用相同的自我報告問卷，在干預階段的 4 個時間點測量咖啡因戒斷症狀，我們發現總體而言，戒斷症狀變化不大，除了無咖啡因咖啡飲用者嗜睡和疲勞感增加（補充圖 S10a）。我們還觀察到無咖啡因參與者在研究開始時「社交性下降、工作動力下降」有所增加，而在含咖啡因參與者中，在 T4 時出現顯著的時間性增加，而「社交性下降、工作動力下降」則顯著減少（補充圖 S10d）。這些發現表明，飲用含咖啡因的咖啡可以改善情緒並減輕戒斷症狀（圖 1C 和補充圖 8-11）。
總體而言，我們發現衝動性和情緒反應受到咖啡的影響；與 NCD 參與者相比，CD 參與者在兩者上的水平都較高，而停止飲用咖啡則會降低這些指標。重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡顯著降低了衝動性，而單獨的無咖啡因咖啡則降低了情緒反應。含咖啡因咖啡改善了焦慮和某些認知表現方面，而無咖啡因咖啡則在記憶、睡眠品質和體能活動方面有所提升，表明咖啡類型具有獨特的益處。總體而言，咖啡攝取和戒斷都調節了自我報告的行為和生理反應，情緒、認知和記憶方面均有顯著改善。
在考慮壓力和皮質醇生理學時，結合了身體不適和社會評價的社會評價冷壓力測試（SECPT）顯示，與 CD 相比，NCD 在自我報告的焦慮（ΔSTAI - 狀態）方面有不顯著的上升趨勢，表明在測試前 NCD 的焦慮水平較高（補充數據 9）。在干預期間，接受含咖啡因和無咖啡因咖啡的參與者在感知壓力、憂鬱和衝動性分數方面均有所下降，表明咖啡攝取能改善情緒，與咖啡因含量無關（補充數據 10）。在研究開始時進行的 SECPT 期間，CD 和 NCD 之間的唾液皮質醇水平沒有差異（補充圖 S3a, b）。無論在干預期間飲用含咖啡因還是無咖啡因咖啡，參與者在 SECPT 期間的唾液皮質醇水平與基線水平沒有差異（補充圖 S7）。在 SECPT 期間，兩組在檢查壓力、情緒和焦慮的自我報告問卷方面變化很小。含咖啡因組在初級評估次級評估（PASA）問卷中，「自我概念」和「次級評估」有所增加，表明應對能力較好，而無咖啡因組則報告了較高的積極情緒量表分數，表明積極情緒水平較高（補充數據 9）。
評估早期晨間皮質醇高峰期的基線壓力反應時，每位參與者都進行了皮質醇覺醒反應（CAR）。基線時 CD 和 NCD 組之間的皮質醇水平相似（補充圖 S3a, b）。同樣，在咖啡戒斷後未觀察到 CAR 的變化（補充圖 S4），表明咖啡因戒斷未影響 CD 的皮質醇水平。在研究的干預階段，含咖啡因組在干預後覺醒時的唾液皮質醇水平較低（補充圖 5a, c）。無咖啡因組的 CAR 保持不變（補充圖 S5b, d），而基線壓力水平和 SECPT 期間的恢復力在兩組的唾液皮質醇方面均無差異（補充數據 S 9）。
檢查周圍血液中的細胞因子分泌時，基線時 CD 的 CRP 水平較低，而 IL-10 水平與 NCD 相比有所升高（補充圖 13，補充數據 S，11）。咖啡戒斷也導致細胞因子水平的變化，CRP 和 TNFα 水平升高，表明咖啡或咖啡因對炎症具有保護作用（補充圖 13，補充數據 S，12）。在干預階段結束時，含咖啡因組的 IL-10 和 IL-6 水平較干預前有所下降（補充圖 13，補充數據 S，13）。在研究重新攝取階段結束時，無咖啡因咖啡攝取增加了 CRP 和 TNFα 水平，而咖啡因攝取則降低了 IL-10 和 IL-6 水平（補充圖 13 和補充數據 11-14）。
在 LPS 刺激外周血後，NCD 參與者在 TLR4 刺激時的 IL-6 增加量大於基線時的 CD。有趣的是，含咖啡因和無咖啡因組在干預後 LPS 刺激時的 IL-6 水平均有所下降，這表明其他咖啡成分可能影響免疫反應。在停止飲用咖啡兩週後，與基線分泌相比，IL-6 分泌顯著增加。比較研究開始時和研究結束時的刺激細胞因子分泌，無咖啡因咖啡飲用者在 TNFα 分泌方面與基線細胞因子水平相比顯著減少（補充圖 S14 和補充數據 14）。
使用 Bristol 糞便量表評估自我報告的胃腸道功能，發現 CD 和 NCD 在糞便一致性方面存在細微差異，CD 在基線時糞便分數有所下降。在停止咖啡因攝取後，CD 參與者的糞便分數與其基線分數相比有所增加（補充圖 2 和補充圖 12）。在研究干預階段的任何時間點，糞便分數均無顯著變化。
當我們比較 NCD 和 CD 參與者之間的非靶向糞便代謝物水平時，我們不可避免地觀察到 CD 參與者糞便中咖啡因水平的變化（圖 2）。此外，我們觀察到 CD 組的茶鹼、1,7-二甲基黃嘌呤和馬尿酸的濃度顯著高於 NCD 組。茶鹼是咖啡生物鹼，1,7-二甲基黃嘌呤是咖啡因的代謝物，而馬尿酸是來自咖啡和其他（多）酚飲食來源或芳香族氨基酸和兒茶酚胺的內源性代謝的酚類代謝物。在 CD 參與者中，吲哚類物質如吲哚-3-丙酸（IPA）和吲哚-3-甲醛（ICA）以及神經遞質γ-氨基丁酸（GABA）顯著降低。吲哚類物質可能是微生物代謝的產物，表明對咖啡攝取存在複雜的代謝反應。在 CD 參與者中，在停止飲用咖啡 2 週後，咖啡因、茶鹼、1,7-二甲基黃嘌呤和馬尿酸的水平顯著降低，而 ICA 顯著增加，這表明 ICA 是對咖啡因缺乏敏感的代謝物，這與 NCD 中的水平也一致。在重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡後，糞便中代謝物濃度的反應有所不同。值得注意的是，咖啡因、茶鹼、馬尿酸和 1,7-二甲基黃嘌呤並未恢復到基線測量水平，而戊糖、馬尿酸和富馬酸的濃度則因咖啡因的存在而有所不同（圖 2）。
相對於基線咖啡飲用者（CD）的非靶向糞便代謝組學熱圖。同一單元格內的水平條表示個別參與者的值。對於咖啡飲用者子集，其中包含重複測量，同一參與者的測量值在 y 軸上對齊。紅色表示正效應大小，藍色表示負效應大小，紅色或藍色的強度對應於效應大小的增加或減少，白色表示零效應。包含數字文本框的面板反映了 Cohen's d 效應大小 > 0.5 的比較，表示中等大小的效應。比較對象為 NCD v CD、清洗期 v CD 基線以及 CAF 或 DECAF v CD 基線值。第一列 = 代謝物，第二列 = NCD，第三列 = CD，第四列為 CD 的清洗期，第五列為含咖啡因或無咖啡因咖啡的重新攝取。基線時 CD 和 NCD 的 n = 31，清洗期為 n = 31，無咖啡因咖啡重新攝取為 n = 15，含咖啡因咖啡重新攝取為 n = 16。
咖啡因在肝臟中的代謝會產生 N-甲基黃嘌呤、甲基尿酸和乙酰化尿嘧啶代謝物。使用針對咖啡和咖啡因相關化合物的靶向尿液代謝組學方法，我們觀察到 NCD 組排泄的 1-和 3-甲基黃嘌呤、可可鹼和幾種甲基尿酸的水平低於 CD 組（補充圖 15）。不出所料，這些代謝物都與咖啡因的代謝有關。除了咖啡因相關代謝物外，CD 組的酚類代謝物尿液水平也高於 NCD 組，包括咖啡oyl奎寧酸、肉桂酸、苯丙酸、苯乙酸和苯甲酸以及羥基苯衍生物。這與咖啡（多）酚對總酚類代謝物排泄的高貢獻完全一致。
在戒斷咖啡因期間後，CD 的尿液代謝物譜幾乎與研究開始時的 NCD 相似，包括生物鹼和酚類代謝物。例外情況是可可鹼、3-甲基黃嘌呤和 3,7-二甲基尿酸，它們與戒斷前水平相比沒有顯著變化。在重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡後，大多數酚類代謝物增加，達到與 CD 值相當的濃度。然而，咖啡因代謝物僅在攝取含咖啡因咖啡後才恢復到 CD 值，而在無咖啡因咖啡則沒有，這符合預期。
總體而言，數據顯示了咖啡衍生的咖啡因和酚類化合物的預期趨勢，儘管不同的代謝物與咖啡的重新攝取比其他代謝物更相關，並且兩種咖啡之間存在一些細微差異。值得注意的是，酚類代謝物存在很大的個體差異，而生物鹼的差異則小得多。這進一步支持了個體腸道微生物群在咖啡（多）酚代謝中起作用（補充圖 15）。
咖啡攝取影響腸道微生物群組成，組間觀察到顯著的菌株特異性差異（圖 3）。在 NCD 的糞便中，與基線時的 CD 相比，隱孢菌（Cryptobacterium curtum）、艾格特氏菌（Eggerthella sp. CAG:209）、艾格特氏菌（Eggerthela sp. Cag 51_9）和厚壁菌門（Firmicutes CAG:94）的菌株顯著減少，而在 NCD 參與者中，小雙 ويل菌（Velonella parvula）、小雙 ويل菌（Velonella sp. ACP1）和流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae）顯著增加。在停止飲用咖啡期間，CD 在此期間的 3 個不同時間點觀察到隱孢菌（Cryptobacterium curtum）水平降低。重新攝取咖啡後，腸道微生物群組成出現顯著改變，與咖啡因含量無關。在重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡後，我們觀察到所有被確定為顯著改變的菌株水平的時序轉變。僅在重新攝取階段的第 21 天，接受含咖啡因和無咖啡因咖啡的參與者中，小雙 ويل菌（Velonella sp. ACP1）出現了顯著的「爆發」。值得注意的是，小雙 ويل菌（Velonella parvula）在無咖啡因咖啡飲用者的糞便中顯著增加，而在 CD 中則沒有顯著增加（圖 3）。
相對於基線咖啡飲用者（CD）的微生物相對豐度熱圖。同一單元格內的水平條表示個別參與者的值。對於咖啡飲用者子集，其中包含重複測量，同一參與者的測量值在 y 軸上對齊。紅色表示正效應大小，藍色表示負效應大小，紅色或藍色的強度對應於效應大小的增加或減少，白色表示零效應。包含數字文本框的面板反映了 Cohen's d 效應大小 > 0.5 的比較，表示中等大小的效應。比較對象為 NCD v CD、清洗期 v CD 基線以及 CAF 或 DECAF v CD 基線值。第一列 = 物種，第二列 = NCD，第三列 = CD，第四列為 CD 的清洗期，第五列為含咖啡因或無咖啡因咖啡的重新攝取。基線時 CD 和 NCD 的 n = 31，清洗期為 n = 31，無咖啡因咖啡重新攝取為 n = 15，含咖啡因咖啡重新攝取為 n = 16。
NCD 和 CD 之間的 Alpha 多樣性存在顯著差異，但在比較 CD 基線多樣性與清洗期後或干預後多樣性時，則沒有顯著差異，這表明咖啡或其某種成分的影響會影響特定菌株而非整體多樣性（補充數據 16）。
我們使用參與者提供的 7 天食物日記中的飲食攝取數據，量化了每日（多）酚含量。比較 CD 和 NCD，CD 組的總（多）酚含量較高，主要反映了酚酸含量較高，特別是羥基肉桂酸（補充數據 17a）。在停止飲用咖啡 2 週後，CD 組的總（多）酚含量有所下降，主要是由於酚酸，特別是羥基肉桂酸的減少（補充數據 17b）。當我們估計（多）酚攝取量，並比較停止飲用咖啡期結束時與參與者攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡的干預期結束時的值時，兩組的總（多）酚、酚酸和羥基肉桂酸均有所增加，而其他（多）酚僅在含咖啡因咖啡組中增加（補充數據 S 17, c）。
腸道微生物群被認為會影響宿主代謝及其自身的代謝潛力。事實上，微生物群和代謝物能夠影響認知和行為。為了研究咖啡攝取（和戒斷）影響的認知、代謝和微生物變化之間的相互作用，我們進行了認知分數、微生物物種豐度和糞便代謝物濃度之間的成對混合模型分析（圖 4）。我們發現小雙 ويل菌（Velonella）物種與茶鹼密切相關，而茶鹼又與多種認知分數密切相關，包括 PSS、PSQI 和 ModRey 等。咖啡本身與所有列出的物種相關，並與所有認知和行為輸出相關。這些數據表明，代謝物和物種都能對咖啡的存在做出反應，並可能影響焦慮。
Sankey 圖總結了微生物物種（左）、代謝物（中）和認知與行為（右）之間的成對統計關聯，基於圖 1、2 和 3 的數據整合。每個節點代表一個物種、代謝物或行為或認知輸出。連接節點的每條線代表該微生物物種、代謝物和認知輸出之間的統計關聯，測量方法為廣義線性混合效應模型。左側（微生物物種）和右側（認知和行為）節點包含 R² 值，代表該欄與中心節點（代謝物）之間的決定係數。連接線的粗細代表該特定模型的邊際（非條件）R² 值，按與該特徵的關聯總 R² 進行縮放。如果 R² > 0.3，線條為不透明；如果 0.3 > R² > 0.1，則為半透明。僅顯示 Benjamini-Hochberg 調整 p 值 < 0.001 的邊際關聯。
我們量化了研究 3 個不同階段的糞便中苯甲酸、苯乙酸、丙酸和肉桂酸衍生物。在 NCD 組中，3-羥基苯甲酸和 3ʹ,4ʹ-二羥基肉桂酸的含量低於 CD 組，而 4-羥基苯甲酸和 3-(3ʹ,4ʹ-二羥基苯基)丙酸在 NCD 組中較高（圖 5）。在停止飲用咖啡 2 週後，CD 組的 3ʹ,4ʹ-二羥基肉桂酸水平顯著降低，與參與者飲食中其咖啡來源前體的減少一致，而 4-羥基苯甲酸水平升高。在重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡後，兩組之間的代謝物濃度沒有明顯差異，3ʹ,4ʹ-二羥基肉桂酸、4-羥基苯甲酸和 3-(3ʹ,4ʹ-二羥基苯基)丙酸的水平與所有參與者在基線水平相比均顯著增加，無論是否攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡。
針對參與者尿液中的靶向（多）酚代謝物進行相同分析，我們看到了微生物物種以及尿酸、黃嘌呤和葡萄糖醛酸家族代謝物對認知輸出的集體影響的進一步證據（圖 6）。
Sankey 圖總結了微生物物種（左）、代謝物（中）和認知與行為（右）之間的成對統計關聯，基於圖 1、2 和 3 的數據整合。每個節點代表一個物種、代謝物或行為或認知輸出。連接節點的每條線代表該微生物物種、代謝物和認知輸出之間的統計關聯，測量方法為廣義線性混合效應模型。左側（微生物物種）和右側（認知和行為）節點包含 R² 值，代表該欄與中心節點（代謝物）之間的決定係數。連接線的粗細代表該特定模型的邊際（非條件）R² 值，按與該特徵的關聯總 R² 進行縮放。如果 R² > 0.3，線條為不透明；如果 0.3 > R² > 0.1，則為半透明。僅顯示 Benjamini-Hochberg 調整 p 值 < 0.001 的邊際關聯。
本研究全面調查了咖啡攝取對健康成人認知、情緒、行為和腸道微生物群的影響，將中度咖啡飲用者與非飲用者進行比較。研究還探討了在為期 2 週的咖啡戒斷期以及隨後重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡期間的變化，以區分咖啡因和咖啡的影響。本研究利用宏基因組學以及靶向和非靶向代謝組學，加深了我們對咖啡如何影響微生物-腸道-腦軸的理解，包括它如何調節壓力、炎症、認知和情緒。
比較規律咖啡飲用者與非飲用者，發現咖啡飲用者表現出更高的衝動性和情緒反應。戒斷後，注意力與警覺性增加，而衝動性與情緒反應降低。行為上，重新攝取含咖啡因或無咖啡因咖啡可降低感知壓力與自我報告的憂鬱症狀。同樣，兩組在重新攝取咖啡因或無咖啡因咖啡後，衝動性也降低了。有趣的是，僅重新攝取含咖啡因咖啡可減輕焦慮和心理壓力，證實了咖啡因對認知和情緒的特定影響，這已被其他研究證實。
進一步探討咖啡對壓力應對能力的影響，包括檢查壓力荷爾蒙皮質醇。評估下視丘-腦下垂體-腎上腺（HPA）軸功能和皮質醇產生顯示，在研究開始時進行的 SECPT 之前、期間和之後的 CAR 和皮質醇水平在咖啡飲用者和非飲用者之間相似。這表明咖啡因或咖啡並未影響兩組對身體和社會壓力的恢復力。其他研究表明，咖啡攝取會激活皮質醇產生，值得注意的是，我們研究設計並未特別檢查咖啡對皮質醇的急性影響。研究還表明，長期飲用咖啡可能會減弱對壓力的皮質醇反應，表明習慣性咖啡飲用者可能對壓力產生部分耐受性。SECPT 前後問卷結果在焦慮、積極和消極情緒、壓力及疼痛感知方面兩組均一致。
鑑於觀察到咖啡因和咖啡對情緒反應的影響，我們試圖探究免疫功能是否參與了這些變化。咖啡飲用者在基線時的急性期蛋白質 CRP 的基礎血漿水平較低，而抗炎細胞因子 IL-10 的水平較高。在 LPS 體外刺激後，咖啡飲用者分泌的 IL-6 顯著少於非咖啡飲用者。這些發現表明咖啡或其成分可能對免疫功能有特定影響，可能由具有抗炎特性的酚類化合物介導。停止飲用咖啡後，CRP 水平與 TNFα 一起升高。關於咖啡對 CRP 水平影響的研究結果存在衝突；雖然一些研究表明黑咖啡攝取與高 CRP 水平呈負相關，但其他研究則表明咖啡攝取與較低的 CRP 水平有關，這表明潛在的抗炎特性。有趣的是，LPS 刺激後 IL-6 水平升高，提供了咖啡影響細胞因子分泌的一致證據。在細胞因子方面觀察到咖啡因的特定影響，重新攝取咖啡因後，參與者的血漿中 IL-10 和 IL-6 均降低，而攝取無咖啡因咖啡的參與者則沒有。在含咖啡因和無咖啡因參與者中，重新攝取咖啡因和無咖啡因咖啡後，LPS 誘導的 IL-6 減半。有趣的是，增加的飲食（多）酚攝取已被證明可降低 CRP 水平，這表明咖啡在飲食誘導的腸道-大腦健康調節中的潛在機制。
我們使用糞便樣本的非靶向代謝組學分析來探討咖啡對宿主的後果。代謝組學分析顯示，咖啡飲用者體內咖啡因和富馬酸等咖啡相關化合物發生了變化。值得注意的是，咖啡飲用者體內的 GABA 和 IPA 等神經活性化合物水平降低。一項近期研究表明，IPA 在改善老年人認知方面起著關鍵作用，透過飲食補充。鑑於 GABA 和咖啡都能影響焦慮，進一步的研究也應探討 GABA 和咖啡的作用。ICA 也發生了變化：ICA 是一種腸道微生物衍生的色氨酸代謝物，已被建議透過細胞因子 IL-10 和芳烴受體（AHR）協同作用，在維持腸道屏障完整性和調節腸道穩態方面發揮關鍵作用。對咖啡因相關化合物的靶向代謝組學分析揭示了咖啡攝取與代謝模式之間的明確聯繫，顯示 NCD 組的 3-羥基苯甲酸水平降低，而 4-羥基苯甲酸水平升高。值得注意的是，停止飲用咖啡及其重新攝取也對這些代謝物濃度產生了顯著影響。
與非咖啡飲用者相比，咖啡飲用者在腸道微生物群方面表現出明顯差異，並觀察到 α 多樣性的變化。這些改變表明咖啡會獨立於飲食影響腸道微生物群。在咖啡飲用者中，特定的物種如隱孢菌（Cryptobacterium curtum）、艾格特氏菌（Eggertella sp.）和厚壁菌門（Firmicutes bacterium）有所增加。關於隱孢菌（Cryptobacterium curtum）和艾格特氏菌（Eggertella CAG:209）的資訊有限，隱孢菌（Cryptobacterium curtum）主要與口腔健康有關，而後者可能參與膽汁酸合成，這與咖啡對酸分泌的影響一致。厚壁菌門（Firmicutes CAG:94）與女性的積極情緒有關。儘管需要進一步研究來闡明這些菌株的具體功能