當受精的哺乳動物卵子分裂時，會產生兩個看似相同的子細胞。其中一些後代細胞會形成胚胎的各種器官系統，而另一些則形成支持發育過程的胚外組織。
2025 年，研究人員利用一項稱為單細胞蛋白質體學（SCP）的尖端技術，證明即使在第一代的兩個細胞中，這種勞動分工已經確立¹。麻薩諸塞州東北大學的 Nikolai Slavov，與加州理工學院的細胞生物學家 Magdalena Zernicka-Goetz 和 Tsui-Fen Chou 共同指導了這項研究。Slavov 表示，這兩個被稱為「alpha」和「beta」的細胞的蛋白質含量，揭示了它們獨特的特性和命運。「Beta 細胞比 alpha 細胞更有可能發育成健康的胚胎，」他說，而 alpha 細胞通常形成胚外組織。該團隊甚至可以追溯到受精階段就已確立了這些細胞身份。
蛋白質在細胞內去向何處？下一代方法繪製了分子的隱藏生命
其他問題也正透過這項技術得到解答。例如，研究人員現在認識到，許多對腫瘤形成具有臨床意義的事件，都源於隱藏在混亂腫瘤環境中的單一細胞。「單細胞蛋白質體學可能有助於我們理解為何患者的預後會因腫瘤演化、免疫反應和細胞分化而異——這些都由細胞異質性驅動，」台北中研院的質譜學家 Yu-Ju Chen 說。
僅僅幾年前，蛋白質生物學家大多認為單細胞蛋白質體學——分析單一細胞中數千種蛋白質的組成——是科幻小說的內容。「我幾乎公開說過『在我有生之年不可能』，因為這似乎太遙遠了，」德國馬克斯普朗克生物化學研究所的蛋白質體學研究員 Matthias Mann 說。但在過去十年中，SCP 不僅成為可能，而且變得實用且具有科學啟發性。Mann 本人現在也是 SCP 的熱衷實踐者，利用它來研究從肝臟疾病到阿茲海默症等各種疾病。然而，進入門檻仍然很高，對昂貴設備、深厚專業知識和處理細胞尺度蛋白質體積所需的方法學精確度的需求，仍然限制了這項技術潛在的變革性影響。
生物學已經深入單細胞時代，但大多數這類分析都集中在轉錄體學。在單細胞層級分析基因表達，可以提供關於細胞身份或生理狀態的寶貴資訊。但研究人員不一定能僅從 RNA 預測細胞的蛋白質含量——並非所有 RNA 都會被轉譯，而且許多因素會影響特定轉錄本的蛋白質產生時間和程度。許多疾病機制最好透過調查蛋白質含量來理解——例如，阿茲海默症和帕金森氏症的病理學與異常的蛋白質聚集密切相關。「蛋白質體反映了細胞的當前狀態，」Mann 說。
為了調查這種狀態，蛋白質體學研究人員通常採用批量分析法，使用質譜法（MS）將數千或數百萬個細胞混合在一起進行分析。這種技術使用專門的儀器將樣本分解成離子化的碎片，然後根據其質量和電荷進行分析。由此產生的「指紋」可以精確識別碎片最初來自的分子，研究人員通常可以檢測到每份樣本中 10,000 種或更多不同的蛋白質。但這是一種平均視角，可能會掩蓋底層的生物學。「它們是否真的反映了所有細胞中正在發生的情況，還是僅僅是某些細胞群體出現了劇烈變化？」哥本哈根大學的質譜學家 Jesper Olsen 问道。「這些是我們以前無法真正解決的問題。」
在某些方面，這項技術應該比其轉錄體學的類似物更簡單。蛋白質比 RNA 更穩定，含量也更豐富。「對於 RNA，我們大多數時候是計算零、一、二、三 [拷貝]；對於蛋白質，我們計算 100、500、10,000，」Slavov 說。但轉錄體學研究人員可以透過使用 PCR 擴增技術來增強細胞 RNA 信號。蛋白質體學沒有這樣的工具，研究人員必須從幾百皮克的材料中學到所有能學到的東西。
從如此微量的樣本中獲得穩健且有資訊的信號，需要高度靈敏的質譜儀——但樣本製備提出了更嚴峻的挑戰。「原始靈敏度是存在的……但樣本製備是針對批量水平進行優化的，」猶他州楊百翰大學的生物化學家 Ryan Kelly 說。
Matthias Mann 的深度視覺蛋白質體學策略為單細胞蛋白質體學增加了空間數據。圖片來源：Axel Griesch/Max Planck Institute of Biochemistry
2018 年，Slavov 領導的團隊展示了在單細胞層級實現廣泛蛋白質體學覆蓋的重要第一步²。研究人員開發了一種稱為 SCoPE-MS（單細胞蛋白質體學質譜法）的樣本製備和分析工作流程，其中他們對感興趣的單一細胞中的蛋白質進行化學標記，然後將這些細胞與過量的未標記「載體」細胞混合。這限制了目標細胞的蛋白質損失，並使蛋白質鑑定更容易，從而能夠在八個單一細胞中檢測到 1,500 多種蛋白質。「我們實際上在靈敏度上獲得了約四個數量級的提升，」他說。
Slavov 回憶說，他的結果發表時受到懷疑，但其他團隊很快就複製了它們。而且重要的是，Kelly 領導的第二個團隊在同年發表了一種獨立的 SCP 方法，使用一種稱為 nanoPOTS 晶片（用於痕量樣本的一鍋納滴處理）的樣本製備設備，在少量單一細胞中鑑定出 670 種蛋白質³。「那些早期論文的重點是，『這是來自單一細胞的真實信號』，」Kelly 說。「這已經不是問題了。」
自那以後，該領域以驚人的速度發展。加州洛杉磯西達斯-西奈醫療中心的臨床蛋白質體學研究員 Jennifer Van Eyk 表示，她的團隊開發了一種工作流程，可以持續鑑定每細胞 1,500–2,000 種蛋白質。「我們看到的生物學簡直令人難以置信，」她說。
蛋白質體學為單細胞和單分子解決方案奠定基礎
而且更深入的覆蓋是可能的。2025 年，兩項獨立研究對每細胞超過 5,000 種蛋白質進行了盤點——這個數字已經被超越。Olsen，其中一項研究的領導者⁴，表示他的團隊有正在審查的工作，其中他們在單一細胞中鑑定出多達 7,000 種蛋白質。維也納分子病理學研究所的蛋白質體學研究員 Karl Mechtler，另一項研究的共同領導者⁵，指出對於一些較大的細胞，「你可以獲得高達 8,000 或 9,000 種蛋白質。」
許多 SCP 實驗室現在依賴 cellenONE，這是法國里昂 Cellenion 公司商業化的一種設備，它可以從培養物或組織樣本中分離單一細胞，同時對其進行成像。這使得使用者能夠記錄每個細胞的形狀和大小，這很重要，因為細胞的體積和蛋白質含量可能差異很大。
下游處理步驟也得到了優化，最大限度地減少了樣本損失並防止了可能混淆數據解釋的交叉污染。雖然蛋白質的化學標記是 Slavov 2018 年出版物中的關鍵步驟，但許多團隊已經採用了更簡單、更快速的無標記方法。例如，Kelly 的團隊在 2023 年開發了一種單一步驟流程，至今仍是他們的首選協議⁶。Chen 和她在中研院的合作者 Hsiung-Lin Tu，已將整個樣本製備過程整合到一個緊湊的微流體設備中。該設備稱為 SciProChip，可在納升體積的液體中執行所有必要的步驟⁷。「該晶片顯著提高了我們的靈敏度、再現性和定量準確性，」Chen 說。
SciProChip 使用微流體技術捕獲、計數和處理單一細胞以進行分析。圖片來源：Hsiung-Lin Tu 和 Yu-Ju Chen
質譜儀的進步也推動了該領域的發展。流行的選擇包括麻薩諸塞州沃爾瑟姆 Thermo Fisher Scientific 的 Orbitrap Astral 系列，以及麻薩諸塞州比勒里卡 Bruker 的 timsTOF Ultra 系列。這些系統採用不同的策略來檢測和定量舊技術無法看到的蛋白質，但成本約為 100 萬美元。「我們可以以更高的靈敏度、更深入、更高通量地定量單細胞中的更多蛋白質，」Slavov 說。然而，他指出，更實惠的舊一代系統對於分析高豐度蛋白質仍然有效。
最大的障礙是速度。大多數 SCP 管線每天最多處理幾百個細胞——比轉錄體學研究的通量低幾個數量級。這主要是因為需要在質譜分析前按大小分離細胞肽。Kelly 說，速度更快可能意味著犧牲寶貴的數據：「當我們從每天 288 個樣本切換到每天 500 個樣本時，我們的蛋白質體覆蓋率確實會受到很大影響。」
單細胞蛋白質體學成為焦點
多重分析提供了一種解決方案，其中單一細胞被標記，即使在細胞被混合處理和分析後，也可以區分每個細胞的數據。例如，Slavov 在 2018 年使用的基於質譜可解析的「串聯質譜標籤」的標記策略，可以同時解析數十個樣本。但標記增加了樣本製備的複雜性，並可能混淆數據分析。「最終，與無標記實驗相比，你得到的肽識別率實際上相當低，」Olsen 說。