科學家開發自動化系統，加速基因密碼的實驗與設計

標準基因密碼使用 64 個密碼子來編碼生命域中的 20 種典型胺基酸。新穎的基因密碼能實現新的化學性質、療法和生態工程，但重新編碼生物體的基因組極具挑戰性 1, 2, 3, 4, 5, 6。在此，我們描述了自動化遺傳 tRNA 擴展（AGENTEX），用於細胞無反應轉譯系統中基因密碼的多重機器人原型製作。核醣體大次單元（LSU）中的兩個 Watson–Crick 交互作用介導了 tRNA 3' CCA 末端的識別，阻止了具有替代 3' 序列的 tRNA 在轉譯過程中被容納 7, 8。基於這些交互作用，我們探討了非 CCA-3' tRNA（otRNAs）被天然胺醯 tRNA 合成酶（aaRSs）胺醯化的程度，從而允許 otRNA 池利用具有改變 LSU 的核醣體來指定獨特的基因密碼。我們開發了多重且自動化的方法來讀取合成 tRNA 文庫中的胺醯化情況。我們發現 tRNA 3' 末端對突變表現出顯著的彈性，允許大多數 otRNAs 被所有大腸桿菌 aaRSs 胺醯化。基於我們的發現，我們開發了細胞無反應轉譯系統，為 34 種密碼子實現了 34 種 aaRSs 的壓縮基因密碼。使用 AGENTEX，我們評估了兩種基因密碼以及標準基因密碼，其中包含非標準胺基酸的併入和最多三個密碼子的重新分配。我們的發現對設計全新的轉譯系統、合成具有多個非標準單體實例的生物聚合物以及理解過去和未來的基因密碼具有啟示意義。

合成基因密碼 1, 2, 4, 5 已實現構建具有新特性的生物體，例如提高病毒抗性、減少水平基因轉移 2, 9, 10，以及生產基因編碼的材料 11, 12、療法 13 和生物催化劑 14。利用工程化核醣體 15, 16, 17、tRNA 18 和 aaRSs 18, 19，基因密碼擴展已實現將 400 多種非標準胺基酸（nsAAs）引入活細胞中的蛋白質 20，以及合成序列定義的聚合物 21, 22, 23。然而，在整個基因組中重新分配少量感應密碼子 3, 6 仍然具有挑戰性，將多種 nsAAs 以高純度併入多肽也是如此。需要更激進的轉譯系統重新設計才能實現從基因序列空間到序列定義化學的完全控制。

鑑於基因組合成和編輯的挑戰，一個完全自動化的工作流程來設計和測試新的基因密碼可以加速基因組工程，將基因組推向自然演化之外，並實現對序列定義聚合物合成的空前控制（圖 1a）。將 64 個密碼子的近乎普遍的基因密碼壓縮到僅 20 個感應密碼子、一個起始密碼子和一個終止密碼子，可以釋放 14 個密碼子用於非標準構建塊（圖 1b 和延伸數據圖 1）。我們預測了一個模組化、自動化、數據驅動的重新設計週期。通過結合客製化裂解液基轉譯系統和攜帶工程化反密碼子的合成 tRNA 池，我們可以快速原型化替代基因密碼並評估它們在多肽合成中的性能（圖 1a）。

a，含有核醣體大次單元中 G2251C 和 G2553C 突變的核醣體（CGA 核醣體）專門容納具有 3' CGA 末端的 tRNA（otRNAs），並且不接受天然 tRNA 進行轉譯。天然 aaRSs 可以在一鍋反應中胺醯化所有 otRNAs，從而允許它們用於轉譯。細胞無反應轉譯系統（裂解液）是通過裂解含有 CGA 核醣體的細胞產生的，並用於後續的自動化工作流程中的轉譯測試。每種基因密碼都作為 otRNA 池合成，通過機器人生產並引入裂解液中。例如，可以提供每種胺基酸的單一 tRNA，從而產生壓縮的基因密碼。同樣，用於多肽轉譯的 mRNA 模板也是自動合成和純化的，所有反應步驟均自動化。otRNAs 在裂解液中被 aaRSs 持續胺醯化，並與 CGA 核醣體專一性交互，同時避免與天然轉譯系統的串擾。每個基因密碼的效果，由 otRNA 池的組成決定，可以被分析並用於快速生成下一個基因密碼實驗。該系統的組成確保了生物遏制，因為 AGENTEX 的組件如果轉移到環境中的活生物體中則無功能。b，壓縮基因密碼的設計。給定 64 個 otRNA 三聯密碼子和正常的擺動規則，20 種典型胺基酸都可以由單一 tRNA 解碼，並且有 14 個密碼子可用於重新分配，以紅色標示。或者，所有 34 個密碼子都可以用於製造類似於非核醣體肽合成酶的肽，使用典型和其他胺基酸的混合物。有關密碼子選擇和開放密碼子設計的更多詳細信息，請參閱延伸數據圖 1。

細胞無反應轉譯平台分為裂解液衍生（裂解液）和 PURExpress（PURE）系統。裂解液來自粗細胞提取物，保留了轉譯機制以及 RNA 和翻譯後修飾的酶 24。PURE 使用單獨純化的組件，包括核醣體、aaRSs、tRNA 和轉譯因子，以定義的比例組合 25。裂解液在基因密碼原型製作方面具有多項優勢，包括支持增強密碼子-反密碼子配對的天然 tRNA 修飾 26, 27、用於生物生產的可擴展性 24, 28, 29 以及與體內系統的相似性 30。然而，裂解液也含有宿主完整的 tRNA 組，這可能與重新分配的感應密碼子發生串擾，並掩蓋合成基因密碼的設計。因此，概念驗證基因密碼擴展研究和定向演化主要在 PURE 中進行 31, 32，儘管 PURE 不太適合製備規模的生物生產。

為了克服這一限制，我們提出了工程化所有 tRNA 的 3' CCA 序列與大腸桿菌核醣體 23S rRNA 中 G2251 和 G2553 鹼基之間的普遍 Watson–Crick 交互作用 7, 8，這確保了轉譯過程中 tRNA 的專一性容納。先前在 PURE 中使用含有 3' CGA 末端的 tRNA 進行短肽轉譯的研究表明，含有 G2251C 和 G2553C 突變的純化核醣體可以容納這些 tRNA 33。然而，這依賴於 flexizyme 充電和每種獨特 tRNA 物種的純化 33, 34，阻止了整個基因密碼的多重測試。我們想知道 aaRSs 是否可以替代地在一鍋反應中胺醯化整個 tRNA 池，從而實現使用工程化基因密碼進行生物聚合物的一鍋合成。通過僅將攜帶非 CCA 3' 末端（otRNAs）的 tRNA 添加到已含有完整 aaRSs 組的裂解液中的工程化核醣體，我們預測了一個無縫、高通量的流程來評估擴展的基因密碼。

然而，長期以來的假設是，3' CCA 序列對於大多數 tRNA 被 aaRSs 成功胺醯化是必需的 35, 36, 37, 38，因為它靠近胺醯化位點，並且在類別 I 和類別 II aaRSs 充電的 tRNA 中普遍存在。先前使用具有突變 CCA 末端的 tRNA 進行體外胺醯化測定報告稱，它們無法被純化的 aaRSs 胺醯化 39, 40, 41。然而，先前的一項研究報告稱，大腸桿菌缬氨醯-tRNA 合成酶對具有 CUA 或 CAA 3' 末端的體外轉錄 tRNA Val 進行了弱胺醯化，儘管 CGA 末端的 tRNA Val 是胺醯化的不良底物 40。因此，我們推測其他 tRNA 可能更能容忍其 3' 末端的較大變異，並試圖確定這種彈性的程度。理解 CCA 序列為何普遍保守也可能為理解轉譯系統的演化和生命的起源提供見解。

在此，我們開發了多重、自動化的方法來量化 tRNA 胺醯化，並應用它們來研究大腸桿菌 tRNA 工程化池的完整序列變異，這些 tRNA 具有多樣化的 3' 末端三核苷酸。利用細胞無反應轉譯、機器人技術、下一代測序和分析化學，我們識別了可容忍的 3' tRNA 序列，這些序列可作為所有 aaRSs 的底物，並在轉譯中進行了測試。我們還測量了所有大腸桿菌 tRNA 同工酶在未修飾狀態下的胺醯化情況與修飾條件下的比較。基於我們的發現，我們開發了 AGENTEX，在多重、自動化的工作流程中構建和測試基因密碼，同時避免了限制先前方法的串擾和繁瑣的操作。使用 AGENTEX，我們構建並測試了用於多肽轉譯和 nsAA 併入的最小基因密碼。這項工作為理解轉譯系統的演化提供了見解，並為基因密碼的進一步演化和擴展提供了可能。

當我們試圖研究缺乏普遍保守的 3' CCA 序列的 otRNAs 的胺醯化時，我們預計會遇到需要新方法的挑戰。tRNA 經歷了所有細胞 RNA 中最廣泛的共價修飾 42。此外，tRNA 的生物發生涉及體內的多步驟成熟，並且難以在活細胞中生產具有非天然結構（如非 CCA 末端）的完整 tRNA 38, 43。由於 tRNA 修飾介導 tRNA–aaRS 交互作用，它們可能會影響胺醯化，特別是如果 CCA 末端發生改變。

為此，我們需要一種多重方法來在複雜池中測量合成 tRNA 的胺醯化，同時避免 tRNA 成熟的挑戰。此外，我們尋求按需修飾 tRNA，以因果關係確定每個 tRNA 的修飾狀態是否影響其胺醯化。據我們所知，沒有這樣的方法可用。先前，已開發出週期酸 tRNA 測序技術，用於通過下一代測序（NGS）量化體內 tRNA 庫 44。我們推測，與將 tRNA 基因庫克隆到細胞中並裂解細胞群體來測序其 tRNA 44 不同，我們可以利用基於裂解液的大腸桿菌細胞無反應轉譯系統來重現體外生產的 tRNA 被裂解液中存在的細胞 aaRS 庫的充電。我們將這種方法稱為通過自動化 NGS 的 tRNA 充電測序（tSCAN）（圖 2a 和補充討論 1）。

a，tSCAN 程序分為 Opentrons OT-2 機器人系統上的單元操作。所有程序都包括孵育、磁性純化或反應設置。程序的每個步驟都繼承自這些基本程序之一（在 b 中編號）。b，tSCAN 協議內的步驟（補充討論 1）。芯片合成的寡核苷酸池（1）被 PCR 擴增成 dsDNA（2）並體外轉錄成 tRNA（3）。細胞無反應反應與 tRNA 孵育（4），然後提取 tRNA（5）。接著進行週期酸氧化、β-消除（6）和脫磷酸化（7）。RNA 在每個步驟中使用磁珠進行純化。然後進行 3' 接頭連接，隨後進行逆轉錄和 5' 接頭連接。cDNA 被 PCR 擴增以添加 Illumina 測序條形碼（8–11）（補充圖 4），然後通過 NGS 讀取文庫（12）。c，d，tSCAN 用於分析來自 M. alvus（c）和 M. mazei（d）的 tRNA 的胺醯化情況。我們確認了這兩種物種已知的正交 tRNA Pyl 的最小充電，並確定了這些生物體中其他 tRNA 與大腸桿菌轉譯系統的交叉反應性。所有數據代表 n = 2 個獨立重複。

我們優化了 tSCAN，將所有 tRNA 純化步驟都用於磁珠，並在開源機器人平台 Opentrons OT2 上自動化了工作流程（圖 2b、補充討論 1 和補充圖 1–5），從而實現了一個用於構建和測試非天然 tRNA 設計的多重管道。胺醯化的 tRNA 免受週期酸氧化保護，並保留 CCA 3' 末端，而未充電的 tRNA 則失去末端腺苷。通過量化每個物種的完整讀數與截斷讀數的比例，我們量化了胺醯化情況。我們檢查了外源 tRNA 對大腸桿菌系統的正交性 22，因為天然大腸桿菌 tRNA 在裂解液中與野生型（WT）tRNA 無法區分。我們合成了來自 Methanomethylophilus alvus 和 Methanosarcina mazei 的所有 tRNA，這兩個物種用於基因密碼擴展 45, 46, 47，作為芯片合成的寡核苷酸池 48 並進行了體外轉錄和純化（方法）。在與大腸桿菌裂解液孵育後，我們發現正如預期的那樣，來自 M. alvus 和 M. mazei 的 tRNA Pyl 顯示出較低的胺醯化效率，這與與大腸桿菌系統的最小交叉反應性一致（圖 2c,d）。其他 tRNA 也顯示出較低的胺醯化，包括 M. alvus 中的 tRNA Ala（圖 2c）和 M. mazei 中的 tRNA Leu（圖 2d），儘管先前未報導為正交，並且可能代表大腸桿菌中額外的正交 tRNA。大多數 M. alvus 和 M. mazei 的 tRNA 被大腸桿菌裂解液胺醯化（圖 2c,d）。

在驗證 tSCAN 後，我們接著測試了一個大腸桿菌 tRNA 文庫，其中 CCA 序列的第二個鹼基是簡併的（CNA），以確定大腸桿菌合成酶是否胺醯化具有此變化的 tRNA。aaRS 對 otRNAs 的廣泛性程度是未知的，並且了解哪些 aaRSs 可以接受 otRNAs 將是開發 AGENTEX 的重要起點。我們通過體外轉錄（IVT）生產了在 tRNA 的倒數第二個位置具有 A、U 或 G 取代的 tRNA，並在大腸桿菌細胞無反應蛋白質合成系統（方法）中於 37 °C 孵育這些 tRNA 2 小時。我們觀察到大腸桿菌 aaRSs 可以為大多數非 CCA-tRNA 充電（圖 3 和延伸數據圖 2a–c），其中 CGA-tRNA 具有最佳的整體充電水平。由於先前檢查具有非 CCA 末端的 tRNA 胺醯化的工作是使用體外純化的 aaRSs 進行的 40，我們選擇使用 PURExpress Δ（aa, tRNA）試劑盒來基準化我們的基於裂解液的測定，其中所有組件都經過親和純化，並且不包含天然 tRNA，而不是全細胞裂解液 25。與基於裂解液的細胞無反應轉譯系統相比，我們預計 IVT 產生的 tRNA 在 PURE 系統中不會添加任何 tRNA 修飾。IVT tRNA 池在 37 °C 孵育 2 小時。我們觀察到大多數 tRNA 的 aaRSs 胺醯化水平要低得多（延伸數據圖 3）。只有約 62% 的具有 CGA 末端的 otRNAs 被大腸桿菌 aaRSs 充電。同時，約 57% 的 CUA otRNAs 被充電，約 42% 的 CAA otRNAs 被充電（圖 3a,b 和延伸數據圖 3a–c）。相比之下，基於裂解液的系統中的可比 otRNAs 都顯示出更高的充電水平（圖 3c,d 和延伸數據圖 2a–c）。

a–d，使用 PURExpress 重構的細胞無反應轉譯系統（a, b）或大腸桿菌裂解液基轉譯系統（c, d）收集的胺醯化數據，根據已知由類別 I（a, c）或類別 II（b, d）aaRSs 胺醯化的 tRNA 進行劃分，以比較每個 aaRS 類別的胺醯化水平。所有數據代表 n = 2 個獨立重複。這些數據也以條形圖的形式顯示在延伸數據圖 2–4 中。

我們提出裂解液和 PURE 轉譯系統之間的差異源於影響 tRNA–aaRS 交互作用的天然 tRNA 修飾，因為 RNA 修飾酶存在於裂解液中但不存在於 PURE 中。我們為所有大腸桿菌天然 tRNA（3' CCA）生產了 IVT tRNA，並在 PURExpress Δ（aa, tRNA）和裂解液系統中比較了在相同條件下的胺醯化情況（圖 3、延伸數據圖 4 和補充討論 2），並對 CNA tRNA 進行了匹配測定。裂解液中的胺醯化水平與先前對大腸桿菌同工酶的測量一致，包括體內絲氨酸和蘇氨酸的低充電率 49，支持 tSCAN 捕捉到生物學上有意義的差異。在 PURE 中，CCA-tRNA 的平均胺醯化率為 56%，CGA-tRNA 為 47%，而在裂解液中，CCA-tRNA 為 67%（延伸數據圖 3 和 4）。儘管在 PURE 中 CCA-tRNA 的胺醯化程度通常高於 CGA-tRNA（延伸數據圖 4a），但一些 CCA-tRNA 在 PURE 中的胺醯化程度低於裂解液，包括 glyT 和 lysQ，它們在 PURE 中約低 50%（延伸數據圖 4b）。

由類別 II aaRSs 充電的 tRNA 通常顯示出比類別 I 更低的胺醯化，特別是絲氨酸和蘇氨酸 tRNA（圖 3b,d），這與先前在大腸桿菌中的報告一致 49。在裂解液孵育的絲氨酸和蘇氨酸 tRNA 中，將 WT CCA 末端改變為 CGA、CUA 或 CAA 會增加胺醯化（圖 3d），但這對於大多數未修飾的 tRNA 則不然（圖 3b）。總體而言，未修飾的 tRNA 的胺醯化程度低於裂解液，特別是對於類別 II aaRSs。結構模型（AlphaFold3）表明 CCA 和 CGA 末端之間存在空間位阻差異，包括 glyT tRNA 的 A75 和 GlyRS 的 Y80 之間的 π–π 堆疊（延伸數據圖 7 和補充討論 2）。

總體而言，裂解液改善了大多數 tRNA 的胺醯化。鑑於 PURE 中的 aaRS 濃度比 tRNA 濃度低 1,000 倍以上 50，並且與裂解液的比例相當 51，這些差異可能反映了有意義的系統特定 aaRS–tRNA 交互作用（即，裂解液與 PURE 的比較）。為了進一步驗證裂解液和 PURE 中的 tSCAN 胺醯化模式，我們使用液相色譜–質譜法（LC–MS）分析了胺醯化情況（補充討論 2）。我們對純化的 aaRS 酶和 IVT tRNA 進行了體外胺醯化反應，然後通過 LC–MS 檢測胺醯化的胺基酸（方法、延伸數據圖 5a，頂部，和補充討論 2）。對具有 3' CCA 或 3' CGA 末端的 leuW、proK 和 valT tRNA 與其同源 aaRSs 的分析與 PURE 中的 tRNA 胺醯化模式相匹配，因為 IVT tRNA 在兩個實驗系統中均未經修飾。我們觀察到所有具有 3' CCA 末端的 tRNA 的胺醯化，但只有 valT 在具有 3' CGA 末端的 tRNA 中被胺醯化（延伸數據圖 5b），對應於 tSCAN 數據（圖 3a,b）。

為了直接檢查裂解液中 tRNA 上胺基酸的身份，我們需要一種新方法，該方法能夠孵育 IVT tRNA 在裂解液中，並區分差異甚至僅一個核苷酸的 tRNA（即，3' CGA 或 CCA 末端）。我們開發了通過質譜法進行的 tRNA 物種充電分析（tSCAN-M），它使用同位素標記的 tRNA 在裂解液中孵育，然後進行消化、分離和 LC–MS 檢測充電的胺基酸物種（延伸數據圖 6a 和補充討論 2）。我們首先通過在 IVT 反應中使用 N15-ATP 體外轉錄天然 Tyr 和 Trp tRNA，並在裂解液中孵育它們以被內源性 aaRSs 胺醯化來驗證 tSCAN-M。在批量消化和沉澱蛋白質後，我們確認了內源性和 IVT Tyr 和 Trp tRNA 都被目標胺基酸胺醯化（延伸數據圖 6b 和補充討論 2）。使用 tSCAN-M，我們分析了在裂解液中具有 3' CCA 或 CGA 末端的 leuW、proK 和 valT tRNA。我們發現所有這些 tRNA 都被這兩種 3' 末端序列胺醯化（延伸數據圖 5c），再次證實了我們在裂解液中的 tSCAN 結果（圖 3c,d）。

繼我們對大腸桿菌 aaRSs 對具有 CGA、CUA 和 CAA 末端的 otRNAs 充電的靈活性感到驚訝的發現之後，我們接著詢問距離末端腺苷兩個鹼基的位置是否也可以多樣化並被 aaRSs 作為胺醯化底物所容忍。我們合成了所有大腸桿菌同工酶 tRNA 的寡核苷酸庫，其中最後一個腺苷之前的兩個末端鹼基 74 和 75 是簡併的（圖 4a）。我們在基於裂解液的大腸桿菌轉譯系統中進行了 tSCAN。我們將 tSCAN 結果的分析繪製成熱圖，其中行對應於 tRNA 末端序列中鹼基 74 的身份，列對應於鹼基 75 的身份。發現許多位置對取代是可容忍的（圖 4b），例如 A 或 U 作為 3' 序列的第一個鹼基。此外，一些 tRNA 對取代表現出較大的整體靈活性，例如 valT、valV、valU 和 pheV。GCA 在約 60% 的 tRNA 中顯示出胺醯化降低，與其他大多數被允許的末端序列形成對比。這很有趣，因為先前已證明 33 WT 大腸桿菌核醣體可以接受少量具有 3' GCA 末端的 tRNA，這些 tRNA 使用 flexizyme 充電，但效率低於具有 3' CCA 末端的天然 tRNA。然而，先前未觀察到 WT 核醣體對具有 3' CGA 末端的 tRNA 的容納 33。GCA 和 CGA 3' 末端之間的這種差異可能表明，如果核醣體選擇無效，則在胺醯化階段對非 CCA-tRNA 的轉譯調控。

所有大腸桿菌同工酶 tRNA 的文庫被合成為 ssDNA 池，並被擴增和轉錄成 tRNA。構成 3' CCA 序列的鹼基 74 和 75 在所有 tRNA 同工酶中是簡併的。將 IVT tRNA 添加到大腸桿菌細胞無反應轉譯系統中，並使用 tSCAN 量化胺醯化情況。測量了所有大腸桿菌 tRNA 的胺醯化百分比，並繪製成熱圖。行代表 tRNA 上倒數第三個位置的核苷酸身份，列代表 tRNA 上倒數第二個位置的核苷酸身份。所有數據代表 n = 2 個獨立重複。

在確定 otRNAs 的充電具有廣泛的靈活性後，我們接著研究了 otRNAs 是否可以在天然轉譯系統中參與轉譯（即，使用沒有 23S rRNA 中 G2251C 和 G2553C 突變的天然核醣體）（補充討論 3）。我們提出 WT 核醣體通過與 tRNA 受體莖的交互作用，即使存在由大腸桿菌 aaRSs 胺醯化的 otRNAs，也只會選擇性地接受具有 CCA 末端的 tRNA（圖 5a）。我們首先使用具有兩個交換密碼子的壓縮基因密碼進行轉譯測試，以測量與標準基因密碼的串擾。基於我們的 tSCAN 數據，我們合成了具有 3' CGA 末端的 otRNAs 的 IVT 池，包括 20 個感應密碼子的 tRNA 和一個起始甲硫氨酸 tRNA（圖 5b 和延伸數據圖 8a）。丙氨酸和絲氨酸的反密碼子被交換（池 MP1），以確定在解碼報告肽信使 RNA（mRNA）時使用的是天然 tRNA 還是 otRNA。我們設計並驗證了肽報告物（ELP-AAA 和 ELP-SSS）的轉譯，這些報告物可以通過 LC–MS/MS 10 檢測，以確定丙氨酸或絲氨酸是否在肽的三个位置被併入（補充圖 9a,b 和補充討論 3）。

a，我們提出核醣體而非 aaRSs 通過與 tRNA 3' 末端的交互作用來嚴格控制基因密碼，因為 aaRSs 可以輕鬆地胺醯化 CCA 和非 CCA tRNA。這阻止了可以與具有非 CCA 3' 序列的 tRNA 一起運行的替代基因密碼。b，為了確定 CGA-tRNA 是否仍能在低水平下被 WT 核醣體容納，我們使用 WT 核醣體的細胞無反應轉譯系統，並引入了可通過 LC–MS/MS 識別的報告肽的 dsDNA 模板。我們進行了 MP1 池（所有 20 種胺基酸和甲硫氨酸起始物）的 CGA-otRNAs 的 IVT，並將 MP1 池引入到也含有大腸桿菌天然充電 tRNA 和大腸桿菌 aaRSs 的細胞無反應轉譯系統中。丙氨酸和絲氨酸的反密碼子被交換，以便我們可以確定在報告肽的丙氨酸密碼子處是否併入了 CGA-tRNA 而不是天然絲氨酸 tRNA。c–j，在細胞無反應轉譯反應中，我們使用了肽 MHHHHHHSKVPGAGVPGAGVPGAGKGGG（ELP-AAA）或 MHHHHHHAKVPGSGVPGSGVPGSGKGGG（ELP-SSS）的 dsDNA 模板，其中胰蛋白酶消化產物 VPGSGVPGSGVPGSGK 或 VPGAGVPGAGVPGAGK 分別可以通過 LC–MS/MS 10 有效檢測。相應肽的洗脫時間以陰影標示。ELP-AAA 肽在存在（c, d）或不存在（e, f）MP1 池的情況下被檢測並通過 LC–MS/MS 確認。在任何情況下都沒有發現 otRNA 誤併入的證據。同樣，ELP-SSS 報告肽在存在（g, h）或不存在（i, j）MP1 池的情況下都被檢測並通過 LC–MS/MS 確認。在任何情況下都沒有發現 otRNA 誤併入的證據。

接下來，我們測試了在存在或不存在交換的壓縮基因密碼 MP1 的情況下的轉譯，以確定 WT 大腸桿菌核醣體對充電的 CGA-tRNAs 的容納水平（補充討論 3）。使用 ELP-AAA 肽作為模板的 dsDNA 進行轉譯後，我們檢測到了 ELP-AAA（圖 5c,d）。我們在沒有 MP1 池添加的對照組中看到了相同的結果（圖 5e,f）。使用交換的 ELP-SSS 報告模板的 dsDNA 進行轉譯後，我們檢測到了 ELP-SSS，但沒有檢測到 ELP-AAA 或任何丙氨酸取代到肽中（圖 5g,h）。我們在沒有 MP1 池添加的對照組中看到了相同的結果（圖 5i,j）。總之，我們未能檢測到 otRNAs 含有 CGA 末端被非特異性容納到 WT 核醣體中進行轉譯的證據。因此，儘管 otRNAs 被所有大腸桿菌天然 aaRSs 胺醯化，但 WT 核醣體充當過濾器，阻止 otRNA 在轉譯過程中被容納。這些發現對我們繼續使用突變核醣體添加到裂解液系統中測試 AGENTEX 具有高度鼓勵性，該系統將專一性地與 otRNAs 交互，同時與標準基因密碼沒有串擾。

由於我們發現 otRNAs 與天然轉譯系統沒有可檢測的串擾，我們接著部署 AGENTEX 來測試壓縮基因密碼並將其應用於翻譯具有擴展基因字母表的蛋白質。我們使用 AGENTEX 測試了一個 22 個密碼子的蛋白質轉譯基因密碼。我們合成了一個最小 tRNA 池（MP2），其中包含具有 3' CGA 末端的 otRNAs，包括一個起始甲硫氨酸 otRNA 和所有典型胺基酸的 20 個 otRNAs（圖 6a 和補充討論 3）。絲氨酸和丙氨酸的密碼子被交換。加入了 Methanocaldococcus jannaschii tRNA Tyr CUA（具有 CGA 3' 末端）來解碼 UAG 並通過其 aaRS 實現對位 azido 苯丙氨酸（pazF）的併入 52（延伸數據圖 8b）。

a，我們使用突變的 CGA 核醣體（23S rRNA 中的 G2251C/G2553C）和 MP2 正交 tRNA（otRNA）池，通過 AGENTEX 測試了壓縮基因密碼 MP2 的轉譯。壓縮基因密碼應由 CGA 核醣體專一性轉譯，並與天然轉譯系統正交。MP2 tRNA 池用單一 tRNA 解碼每種典型胺基酸，絲氨酸和丙氨酸的反密碼子被交換。M. jannaschii tRNA Tyr CUA 解碼 UAG 密碼子並併入對位 azido 苯丙氨酸（pazF）。b，使用 h-TAG-1 報告物評估轉譯效率和保真度，該報告物包含一個用於 pazF 的 TAG 密碼子和交換的 Ser/Ala 密碼子。標準密碼轉譯會產生截斷或誤轉譯的 h-TAG-1，發光度降低，而壓縮密碼則產生全長的 h-TAG-1，通過全長的 HiBiT 重構螢光素酶功能（補充討論 3）。c，使用 WT 或 CGA 核醣體裂解液，有或無 pazF、pazFRS 和報告模板，在 AGENTEX 中轉譯了 h-TAG-1。在終端測定中測量了發光度。數據代表 n = 3 個獨立重複（平均值 ± 標準差）。使用 Student's t 檢驗計算相對於 WT 核醣體條件和所有變量存在的統計顯著性（最左邊的條形），其中 NS 表示不顯著，P > 0.05，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。d–h，為了驗證肽產物並評估轉譯串擾，我們使用了 ELP-SAS 報告物，其中包含三個密碼子的身份取決於用於其轉譯的基因密碼，並且可以通過 LC–MS/MS 輕鬆識別（補充圖 12）。在 CGA 核醣體和 MP1 池存在下，檢測到了交換的和標準密碼的產物，但沒有混合的丙氨酸/絲氨酸串擾產物；MS/MS 確認了交換的（e）和標準密碼的（f）產物。在 WT 核醣體下，僅檢測到標準密碼產物（g），並通過 MS/MS 確認（h）。a.u.，任意單位。

與之前一樣，我們設計了 AGENTEX 的自動化程序，使用客製化 Python 代碼控制 OT-2 機器人中的所有單元操作，並將數據表示與機器人執行分離（補充圖 10 和補充討論 3）。壓縮基因密碼被生成，以指定典型胺基酸的最小密碼子集，並能夠修改 tRNA 的反密碼子以最大化密碼子空間。

我們開發了一種高靈敏度的發光報告物測定法，用於通過 AGENTEX 快速測試重碼基因密碼的轉譯。我們的報告物基於 HiBiT 肽，它與 LgBiT 結合可重構螢光素酶功能，從而能夠通過發光定量測量其產量（圖 6b 和補充討論 3）。我們構建了一個工程化肽（h-TAG-1），其中一個短肽（MGVGXGVG，其中 X 是 UAG 密碼子）位於 HiBiT 序列之前。我們使用 AGENTEX 和一個 22 個密碼子的代碼以及 MP2 tRNA 池（延伸數據圖 8b）測試了轉譯。成功的轉譯會產生完整的 HiBiT 肽，並在 LgBiT 互補後產生發光。如果 MP2 tRNA 未被容納，由於缺乏 M. jannaschii otRNA Tyr CUA 的抑制，轉譯會提前終止，並且 HiBiT 包含兩個錯誤的丙氨酸而不是絲氨酸。我們在含有 WT 或 CGA 核醣體的裂解液中進行了有或無 pazF 的轉譯。使用 CGA 核醣體，MP2 和 pazF（+pazF, +pazFRS）的 HiBiT 產量約為 WT 裂解液的六倍，約為無模板對照組的十倍（圖 6c）。這表明使用 CGA 核醣體和 MP2 的正確信息轉譯更成功（補充討論 3）。在沒有功能性 pazFRS（+pazF, −pazFRS）的 WT 和 CGA 裂解液中轉譯時，發光度處於背景水平（圖 6c），表明 CGA 核醣體在 +pazF, +pazFRS 下的高信號反映了正確的解碼（約為背景的六倍，P < 0.001）。

為了確定 otRNAs 是否被 CGA 核醣體容納以及是否存在與天然核醣體的任何串擾，我們使用 LC–MS/MS 進行了肽檢測（補充討論 3）。我們使用 ZenoTOF7600+ 質譜儀，其靈敏度高達 100 倍於 Q Exactive Orbitrap 53，以提高對罕見串擾事件的檢測能力（方法）。我們使用 MP1 tRNA 池（延伸數據圖 8a）的 21 個密碼子代碼在 WT 和 CGA 裂解液中測試了 AGENTEX，用於生產肽 ELP-SAS（圖 6d–h 和補充圖 12）。我們使用 ELP-SAS 是因為它有三個密碼子的胺基酸身份將取決於用於其轉譯的基因密碼，並且可以通過 LC–MS/MS 有效識別。由於 ELP-SAS 長度為 32 個胺基酸，它也將測試 otRNAs 單獨解碼此長度肽的能力（補充討論 3）。我們監測了所有樣品中的 GVPG J GVPG J GK，其中 J = A 或 S。分析了與肽預期質量相符的提取離子色譜圖（EICs）（延伸數據表 1），並從中生成了 MS/MS 光譜。在 CGA 裂解液中，檢測並確認了 GVPG A GVPG S GK（擴展基因密碼）和 GVPG S GVPG A GK（標準基因密碼）（圖 6d–f），這符合預期，因為該樣品中存在兩種轉譯系統，其中 GVPG S GVPG A GK 的豐度較高（補充圖 13）。我們沒有檢測到 GVPG S GVPG S GK 或 GVPG A GVPG A GK，表明沒有串擾（圖 6d）。與 GVPG A GVPG S GK 質量相符的非特異性洗脫物（延伸數據表 1）未通過 MS/MS 確認，是一個假陽性結果。在對所有與我們的文庫搜索匹配的肽進行分析以及對 MS/MS 光譜進行手動檢查後，沒有發現其他丙氨酸/絲氨酸取代，表明沒有可檢測的串擾。在 WT 裂解液中，僅檢測到 GVPG S GVPG A GK（圖 6g,h），這與我們先前在 otRNAs 存在下對 WT 核醣體的分析一致（圖 5）。我們沒有檢測到任何其他表明轉譯串擾的肽（圖 6g）。這些發現與在 MP2 otRNA 池存在下 CGA 核醣體的 HiBiT 活性增加的結果一致。總體而言，這些數據證明了具有擴展基因字母表的肽和兩種壓縮基因密碼的轉譯。當核醣體中存在 PTC 突變（如 G2251C 和 G2553C）時，otRNAs 被天然 aaRSs 胺醯化，並被選擇性且有效地併入多肽中。

我們開發了 AGENTEX，並展示了其通過機器人工作流程從 dsDNA 組裝和 tRNA 生產到多肽轉譯和純化，用於測試多種基因密碼以生產具有擴展基因字母表的多肽的能力。我們確定我們可以避免與天然轉譯系統的可檢測串擾，並對多種壓縮基因密碼進行了原型製作。此外，我們開發了新的方法 tSCAN 和 tSCAN-M，用於量化細胞無反應轉譯系統中合成 tRNA 池的胺醯化情況，並識別其酯化胺基酸。與先前的工作相比，使用 tSCAN，我們可以利用實驗室自動化快速測試多種外源 tRNA 設計，控制轉譯系統的組成，並確定 tRNA 上充電胺基酸的身份。利用這項技術，我們研究了來自 M. alvus 和 M. mazei 的正交 tRNA，表徵了自然界中最保守序列之一 tRNA 的 CCA 末端的生化靈活性，並在 RNA 修飾缺失或可能發生的條件下，研究了大腸桿菌所有同工酶 tRNA 的胺醯化情況。tRNA 對所有生物的生物學都至關重要，tRNA 的突變可能導致人類疾病，如聽力損失和糖尿病 54。許多 tRNA 和人工基因密碼構建的研究可以從讀取 tRNA 胺醯化以及 tRNA 修飾狀態和酯化胺基酸身份的能力中受益。

我們的結果表明，儘管 tRNA CCA 末端在 tRNA 功能中起著至關重要的作用 35, 36, 37, 38，但其序列可以表現出顯著的靈活性，而不會損害其與 aaRSs 交互的能力。通過全面改變所有大腸桿菌 tRNA 的 3' CCA 末端的兩個鹼基並測試其胺醯化效率，我們確定了哪些序列模式被 aaRSs 所容忍。許多非 CCA-tRNA 變體保留了顯著的胺醯化效率，這表明 CCA 序列對突變的耐受性比先前預期的要高。此外，這種靈活性可能被低估了，因為先前使用純化的 aaRSs 和體外 tRNA 的研究未能考慮到天然 RNA 修飾。我們證明，完整的細胞背景（即，在裂解液中），而不僅僅是純化的轉譯系統組件（即，在 PURE 或體外胺醯化反應中），對於大多數具有不同 3' 末端的 tRNA 的胺醯化是必需的，我們認為這反映了對適當修飾的要求 42, 55, 56。我們在裂解液和 PURE 系統條件下對 CCA-tRNA 充電的比較（圖 3 和延伸數據圖 4）強調，即使是 CCA-tRNA 在天然條件下也優先被胺醯化。對於具有不同 3' 末端的 tRNA，這種模式似乎更為明顯。我們還使用 PURE 系統中的純化 aaRSs 發現，只有一部分 aaRSs 為非 CCA-tRNA 充電，這表明 tRNA 修飾調節了識別和胺醯化（補充討論 4）。

我們的發現進一步幫助我們修正了將轉譯系統視為從基因組到蛋白質組在基因密碼維持方面的線性進程的觀點（延伸數據圖 9a），而是視為一個多層次系統，其中基因密碼由轉譯裝置主動維持（延伸數據圖 9b 和補充討論 4）。儘管 aaRSs 可以胺醯化具有改變的 3' CCA 序列的 tRNA，但核醣體是主要的過濾器，而具有匹配突變的核醣體可以容納這些變異 tRNA，從而提高了在單個細胞內存在並行基因密碼的可能性。這種特徵可能起源於最後一個普遍共同祖先之前，在 DNA 基因組 57 或 aaRS 蛋白質 58, 59 之前的 RNA 世界中（補充討論 4）。我們還發現 tRNA 修飾影響類別 I 和類別 II aaRSs 的 aaRS 識別，當 CCA 序列發生突變時，胺醯化改變會更加明顯（延伸數據圖 9b）。這些結果表明，tRNA 修飾可以提供第二層調控，有助於保留標準基因密碼。總之，我們提出核醣體、tRNA 及其修飾狀態的協調變化可以實現替代基因密碼，但強烈的選擇壓力通常會阻止它們的出現。

基於這些發現，我們成功地使用 AGENTEX 將 64 個密碼子的標準基因密碼壓縮為由 22 個 tRNA 指定的簡化基因密碼（21 個具有感應反密碼子的 tRNA 和一個具有終止反密碼子的 tRNA），從而實現了理論上由 20 種典型胺基酸和 14 個開放密碼子組成的基因密碼（34 個密碼子的基因密碼）。使用此代碼，我們轉譯了具有 nsAA 和三個重新分配密碼子的蛋白質。這項工作例證了 AGENTEX 如何能夠快速探索自然界中不存在的基因密碼（補充討論 5）。此外，我們展示了兩種基因密碼在同一轉譯系統中並行運行：我們的壓縮基因密碼和標準基因密碼。我們預計這些見解將能夠在體內構建具有多達 14 個開放密碼子的基因密碼，用於非標準單體併入。

總體而言，這項工作為快速測試與其自然對應物相距甚遠的基因密碼奠定了基礎。這項工作的未來應用將有助於構建具有重碼基因組和體內並行基因密碼（依賴於正交核醣體、tRNA、aaRSs 和 mRNA）的新生物體。我們的技術提供了一個通用解決方案，用於在 mRNA、核醣體、tRNA 和蛋白質水平上評估細胞無反應系統中基因密碼的全部動態，並內置生物遏制（補充討論 5）。該技術的細胞無反應性質使得能夠快速安全地測試高度不同的基因密碼。即使沒有完整基因組的背景，許多基因密碼的動態在這個層面上也是有後果的。這項工作的未來發展可能會擴展在 AGENTEX 評估基因密碼時可以在體外使用的機制測定，包括多個基因在 mRNA 二級結構中的變化、編碼序列的變化、轉譯過程中的核醣體佔有率、不同基因密碼下的轉譯速率和轉譯準確性。然而，我們也認識到，新基因組的構建涉及超越基因密碼考慮的高階交互作用，例如染色體組織和整個代謝途徑 60。與這裡使用的快速設計-構建-測試週期類似，我們預計 AGENTEX 將在菌株構建之前有效地評估許多新的基因密碼設計，從而顯著降低未來基因組工程的風險。這些能力對於構建與現存生命具有根本不同特性的生物體以及促進非標準單體組成的生物聚合物的細胞合成至關重要。

含有 T7 啟動子下的 tRNA 並跟隨 HDV 核酶 61 的寡核苷酸由 IDT 作為高保真 DNA 微芯片寡核苷酸池合成，長度為 254–275 個核苷酸，並且 dsDNA 在每個池的單個 PCR 反應中被擴增。這些 tRNA 池包括所有鹼基 75 的組合、所有鹼基 74 和 75 的組合（通過機器混合引入簡併性）以及所有 M. alvus 和 M. mazei 同工酶 tRNA 的 48 個獨特大腸桿菌同工酶 tRNA。IVT 反應在 37 °C 下使用擴增的 tRNA dsDNA 作為模板，使用 NEB HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit 進行，並添加 ATP、CTP、GTP、UTP、反應緩衝液、200 ng dsDNA 模板和 T7 RNA 聚合酶。逆轉錄後，進行多核苷酸激酶處理以脫磷酸化 tRNA 3' 末端 62。通過 SPRIselect 磁珠純化並進行尺寸選擇的 IVT 產生的 tRNA。通過在 80 °C 加熱 5 分鐘並緩慢冷卻至室溫來重新折疊 tRNA。在 50 °C 下，添加 MgCl2 至最終濃度 10 mM。

為了從 tRNA 池中擴增單個 tRNA，為每個 tRNA 設計了一個獨特的引物，涵蓋 T7 啟動子和 tRNA 的 5' 獨特序列。與池擴增使用相同的反向引物。或者，合成並擴增了單個 tRNA 序列。

總共 40–120 µg 的 IVT tRNA 文庫在 200 μl NEBExpress Cell-free E. coli Protein Synthesis System（New England Biolabs）或我們準備的客製化細胞裂解液轉譯系統（見下文）中孵育，並在 37 °C 孵育 2 小時。或者，將 40–120 µg 的 IVT tRNA 文庫在 NEB PURExpress Δ(aa, tRNA) 試劑盒中孵育，並在 37 °C 孵育 2 小時。

將細胞沉澱懸浮在 1 ml TRIzol（Thermo Fisher）中並在 -80 °C 凍結。加入 1-溴-3-氯丙烷（1/10體積），渦旋樣品並在 4 °C 下以 15,000 × g 離心 15 分鐘。將水相轉移到含有 400 μl 70% 乙醇的新管中。然後使用改良的 RNeasy MinElute Cleanup Kit 協議（Qiagen）分離短 RNA，以尺寸選擇 <200 nt 的 RNA。將樣品在室溫下以 12,000 × g 通過 MinElute 離心柱離心 5 分鐘。將流穿液加入 450 μl 100% 乙醇中，並在室溫下以 12,000 × g 在新的 MinElute 離心柱中離心。用 80% 乙醇在 50 mM 乙酸鈉中洗滌柱三次，並在 12,000 × g 下打開蓋子乾燥 5 分鐘。樣品用 50 mM 乙酸鈉和 1 mM EDTA 進行洗脫。

週期酸氧化在 10 μg 總 RNA 中進行，該 RNA 在 10 mM 乙酸鈉和 50 mM NaIO4 中分離。反應在 22 °C 下孵育 30 分鐘，並用 100 mM d-葡萄糖淬滅 5 分鐘。使用 SPRIselect 磁珠（Beckman Coulter）對樣品進行尺寸選擇，並用 RNase-free 水進行洗脫。β-消除和脫胺醯化在 60 mM 四硼酸鈉中於 45 °C 孵育 90 分鐘。使用 SPRIselect 磁珠純化並進行尺寸選擇 RNA。使用 New England Biolabs T4 Polynucleotide Kinase 試劑盒按照製造商的協議去除 3' 磷酸基團。脫磷酸化的 RNA 使用 SPRIselect 磁珠進行純化。

使用 New England Biolabs T4 RNA Ligase 2, 截短 KQ 試劑盒將 tRNA 連接到 3' 預腺苷化接頭寡核苷酸，以將 DNA 寡核苷酸的腺苷化 5' 端連接到 RNA 樣品的 3' OH。根據製造商的協議，反應在 25 °C 下進行 2 小時並用 0.5 M EDTA 淬滅，隨後使用 SPRIselect 進行尺寸選擇。使用 Maxima H Minus Reverse Transcriptase 63 進行引物依賴性逆轉錄反應。總共 50 ng 的 3'-接頭連接樣品與 6 pM RT 引物和 20 mM dNTP 混合物在 75 °C 下孵育 5 分鐘以變性引物，並根據製造商的協議添加到 Maxima 試劑盒組件中。孵育後，通過添加 NaOH 並在 95 °C 下孵育 3 分鐘進行鹼性水解，並用 HCl 中和溶液。使用 SPRIselect 對樣品進行純化。使用 New England Biolabs Thermostable 5' App DNA/RNA Ligase 根據製造商的協議連接 5' 接頭，並使用 SPRIselect 對接頭連接的樣品進行尺寸選擇。條形碼被添加到 3