十年前，張穎（Ying Zhang）發現自己正處於一場醫學革命的前沿。
張穎是瑞士楚格市CRISPR Therapeutics公司最早聘用的科學家之一。這家生物技術公司成立於2013年，旨在利用CRISPR-Cas9基因編輯技術治療疾病。該技術剛發表不久，張穎和她的同事們便夢想著如何將這個創新工具付諸實踐。
但她很快就感到沮喪。她的許多計畫都需要用一個健康的基因副本替換整個有缺陷的基因——而她很快就發現，這對於CRISPR-Cas9來說是一個挑戰。「剛開始的時候，我們充滿了興奮，」張穎說。「當我們實際完成所有工作時，才發現它比我們想像的要複雜得多。」
如今，情況已經有所改善。現在任職於中國武漢大學的張穎和她所在領域的其他人，正在開發一個快速發展的基因組改寫工具箱，無論是用於治療還是基礎研究。有些方法建立在CRISPR-Cas9的基礎上；有些則已完全擺脫了它。「這是一場新技術的瘋狂爆炸，」加州拉霍亞市斯克里普斯研究所的生物工程師Shannon Miller說。
這些技術仍處於早期階段，各有優缺點。沒有一種技術能像CRISPR-Cas9那樣，在更簡單的DNA編輯任務中展現出簡便性和多功能性。選擇哪種方法取決於需要插入的DNA大小、在基因組中的位置以及正在修改的細胞類型（見「大型基因編輯簡介」）。「有這麼多不同的選擇，」紐約州塔里敦市Regeneron神經治療部門主管Amy Pooler說。「這不會是一種一刀切的方法。」
方便且多功能，CRISPR-Cas9基因編輯技術在進行DNA序列的小幅修改以消除基因功能時，確實表現出色。一種相關且更精確的技術，稱為鹼基編輯（base editing），利用CRISPR機制改變單個DNA「字母」。
這兩種技術都已用於人體疾病的治療，但它們都有局限性。CRISPR-Cas9基因編輯工具必須先斷開DNA才能進行修改。Cas9酶會在目標位點切割DNA的兩條鏈，研究人員則依賴細胞自身的、容易出錯的修復機制來封閉缺口。這些編輯的結果可能難以預測，並且經常會使基因失活。
而鹼基編輯必須針對個體的DNA進行客製化，這使得它對於某些疾病來說過於精確，不夠實用。例如，Stargardt病是一種遺傳性視力喪失，可能由ABCA4基因的一千二百多種變異引起，其中約七百五十種可以通過鹼基編輯進行糾正。但要治療所有這些變異，就需要數百種不同的鹼基編輯療法。「開發一種只有一個病患的藥物是不現實的，」張穎說。「如果你能植入整個健康的基因，你至少可以用一種治療方法覆蓋一種遺傳疾病。」
一些研究人員希望利用大型基因插入來賦予細胞新的功能。例如，這種技術可以讓嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法具備產生免疫刺激蛋白或僅在腫瘤附近激活細胞的基因開關的能力。
此外，從事基礎研究的科學家可以操縱大型DNA片段，以創建更優良的人類疾病模型、重現代謝途徑、探究基因組結構與功能的關係以及構建合成染色體。
然而，CRISPR-Cas9並非總是實現這些目標的理想工具。它可以插入DNA，但其效率隨著片段變大而降低，因此研究人員通常使用它來處理短於2,000個鹼基對的DNA片段。該技術在非分裂活躍的細胞（如神經元）中也可能難以使用。另一種基於CRISPR的技術，稱為prime editing，可以在不破壞兩條DNA鏈的情況下插入序列，但它只能容納幾百個鹼基。「這確實是該領域的一個瓶頸，」在俄亥俄州立大學開發基因編輯技術的Bin Liu說。
為了克服這個瓶頸，研究人員一直在將CRISPR基因編輯工具的元素與其他能夠將大型DNA片段縫合到基因組中的酶結合起來。例如，哈佛醫學院的基因工程師Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg開發了一種方法，該方法利用一種能夠將數萬個DNA鹼基縫合到基因組中的酶¹。
這種酶稱為大型絲氨酸整合酶（large serine integrase），它可以在無需破壞兩條DNA鏈的情況下將DNA插入特定位點。Abudayyeh和Gootenberg使用了一種名為Bxb1的整合酶。他們利用prime editing引入位點（稱為著陸墊），並使用與Bxb1偶聯的Cas9蛋白來插入DNA。該團隊將這項技術命名為PASTE。
研究人員在現已關閉的Tome Biosciences公司（由Abudayyeh和Gootenberg共同創立）中使用PASTE的一種變體，在食蟹猴（Macaca fascicularis）中替換了一種與B型血友病（一種人類血液疾病）有關的基因²。研究人員報告稱，單次治療後，約一半動物的肝細胞含有糾正後的版本。
但PASTE需要多個組件：一種切割目標位點DNA單鏈的修飾Cas9酶；著陸墊序列；將著陸墊複製到基因組中的逆轉錄酶；整合酶；導引RNA；以及供體DNA。
為了將所有這些組件引入猴子實驗中的細胞，研究人員使用了兩種遞送方法：一種是脂質納米顆粒，攜帶編碼酶和導引RNA的信使RNA；另一種是稱為腺相關病毒（AAV）的病毒，攜帶供體DNA和著陸墊序列。「這些複雜性加起來了，」Abudayyeh說。「我們在肝臟中達到了50%的效率，但要靶向任何其他器官都變得相當困難。」
其他方法則更為複雜。例如，移動DNA元件稱為轉座子。在稱為轉座酶的酶的幫助下，許多轉座子可以看似隨機地插入DNA。但CRISPR相關轉座子（CASTs）如果提供導引RNA和兩端帶有轉座子序列的供體DNA，就可以靶向基因組中的特定位點。
Sam Sternberg（紐約市哥倫比亞大學生物化學家）和David Liu（馬薩諸塞州麻省理工學院和哈佛大學Broad研究所化學生物學家）已經優化了一種用於人類細胞的此類系統。該系統稱為evoCAST，可以將多達15,000個DNA鹼基插入人類細胞，包括基因組中幾個治療相關的位點³。
但一些evoCAST設計涉及六到七種蛋白質——這對於目前的遞送方法來說是一個沉重的負擔。「一個重點一直是將組件數量精簡到盡可能少的分子，並研究不同的遞送方法，」Sternberg說。
相比之下，Miller正在轉向「重組酶工程」（recombineering）——一種基於遺傳重組的技術，用於改寫細菌的基因組。她的系統大約有1,500個鹼基對（不計供體DNA），可以根據供體DNA的大小打包到單個AAV基因組中⁴。Miller和她的同事們正試圖提高該系統在人類細胞中的效率。
另一類移動遺傳元件，稱為R2逆轉錄轉座子，可以完全以RNA分子的形式遞送，並包裝在脂質納米顆粒中，後者比AAV能攜帶更大的貨物。
但將逆轉錄轉座子靶向特定的基因組區域需要重新設計逆轉錄轉座子的DNA結合域——這是一項比改變導引RNA更具挑戰性的任務。因此，研究人員通常將供體DNA縫合到基因組中預定的「安全港」區域，那裡不太可能造成危害。
